qPCR(정량적 중합효소연쇄반응)은 PCR 기술을 활용하여 샘플 내 DNA의 양을 측정하는 정교한 분석 기술입니다. 고급 분석 절차이지만, 엑셀만 있으면 누구나 qPCR 데이터를 손쉽게 분석할 수 있습니다. 이 글에서는 엑셀에서 qPCR 데이터를 분석하는 두 가지 방법을 단계별로 소개합니다. 실습 파일을 다운로드하여 함께 따라 해 보세요.
qPCR 분석이란 무엇인가?
qPCR(quantitative polymerase chain reaction)은 PCR(중합효소연쇄반응)을 이용해 샘플 내 DNA의 양을 정량적으로 측정하는 기술입니다. qPCR 데이터를 분석하는 대표적인 방법으로는 두 가지가 있습니다.
더블 델타 Ct(Double Delta Ct) 방법
2001년 Livak과 Schmittgen이 명명한 더블 델타 Ct 방법은 Pfaffl 방법의 특수 사례에 해당합니다. 이 방법에서는 두 세트의 평균 실험 데이터(실험군 목표유전자, 하우스키핑 유전자 실험군)와 대조 데이터(대조군 목표유전자, 하우스키핑 유전자 대조군)를 입력해야 합니다.
∆CTE는 실험군 목표유전자(TE) 값에서 실험군 하우스키핑 유전자(HE) 값을 뺀 값입니다.
마찬가지로 ∆CTC는 대조군 목표유전자(TC) 값에서 대조군 하우스키핑 유전자(HC) 값을 뺀 값입니다.
그다음 ∆∆Ct 값을 계산합니다. 계산 공식은 다음과 같습니다.
마지막으로 유전자 발현 비율(Gene Expression Ratio)을 구합니다. 이 방법에서는 실험군과 대조군 모두의 프라이머 효율(Primer Efficiency)을 100%로 가정하므로, 발현 비율 공식은 다음과 같습니다.
Pfaffl 방법
Pfaffl 방법은 qPCR 분석의 일반적인 표준 방법으로, 더블 델타 Ct 방법과 유사하지만 결정적인 차이가 있습니다. 바로 프라이머 효율이 100%가 아니어도 된다는 점입니다. 일반적으로 하우스키핑 유전자(HKG)와 관심 유전자(GOI)의 프라이머 효율은 90%~110% 사이의 값을 가집니다. 이 분석 공식은 2001년 Michael Pfaffl이 학술지 Nucleic Acids Research에 발표했습니다.
이 방법에서도 두 세트의 데이터를 입력하고 각각의 평균값을 계산한 뒤, 대조군 샘플의 평균값을 구하여 ∆Ct 값을 산출합니다.
그리고 유전자 발현 비율을 구하는 수학적 공식은 다음과 같습니다.
엑셀에서 qPCR 데이터 분석하기: 2가지 방법
이제 5개의 DNA 샘플 데이터를 예시로, 먼저 더블 델타 Ct 방법을 적용한 후 Pfaffl 방법을 순서대로 실습해 보겠습니다.
1. 더블 델타 Ct 방법으로 qPCR 데이터 분석하기
더블 델타 Ct 방법에서는 실험 유전자와 대조 유전자의 PCR 프라이머 효율을 모두 100%로 가정합니다. 즉, Pfaffl 방법의 특수 사례라고 볼 수 있습니다. 아래 단계를 따라 진행하세요.
📌 단계:
- 먼저 이미지와 같이 모든 유전자 값을 정확히 입력합니다. 실험군 목표유전자(TE)와 실험군 하우스키핑 유전자(HE)의 실험값은 각각 B열과 C열에, 대조군 목표유전자(TC)와 대조군 하우스키핑 유전자(HC)의 값은 각각 D열과 E열에 입력합니다.
- 이제 셀 F6에 다음 수식을 입력하여 ∆CTE 값을 계산합니다.
=B7-C7
- Enter 키를 누릅니다.
- 마찬가지로 ∆CTC 값을 구하기 위해 셀 G6에 다음 수식을 입력합니다.
=D7-E7
- 다시 Enter 키를 누릅니다.
- 그다음 셀 H6을 선택하고 다음 수식을 입력하여 ∆∆Ct 값을 구합니다.
=F7-G7
- Enter 키를 누릅니다.
- 마지막으로 유전자 발현 비율, 즉 2^(−∆∆Ct) 값을 계산하기 위해 셀 I6에 다음 수식을 입력합니다.
=2^(-H7)
- 마지막으로 Enter 키를 누릅니다.
- 이후 셀 범위 F6:I6을 선택합니다.
- 채우기 핸들(Fill Handle)을 더블클릭하여 수식을 10행까지 자동 복사합니다.
모든 샘플의 유전자 발현 비율 값이 한 번에 계산됩니다.
이렇게 하면 엑셀에서 qPCR 데이터 분석이 성공적으로 완료됩니다.
🔍 결과 해석
셀 I6의 유전자 발현 비율 0.6507이라는 값은, 실험 조건의 유전자 샘플들이 대조 조건 대비 하우스키핑 유전자로 정규화되었을 때 약 65.07%의 유전자 발현을 나타낸다는 의미입니다. 백분율 개념으로 해석하면 실험 조건에서의 발현량이 대조 조건의 약 65% 수준이라고 이해할 수 있습니다.
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2. Pfaffl 방법으로 qPCR 데이터 분석하기
이번에는 Pfaffl 방법을 사용해 보겠습니다. 이 방법이 더블 델타 Ct 방법과 다른 핵심은 프라이머 효율이 100%가 아니어도 된다는 점입니다. 이 예시에서는 하우스키핑 유전자의 프라이머 효율을 93%, 관심 유전자의 프라이머 효율을 101%로 가정합니다. 아래 단계를 따라 진행하세요.
📌 단계:
- 먼저 이미지와 같이 모든 유전자 값을 정확히 입력합니다. 하우스키핑 유전자(HKG)와 관심 유전자(GOI)의 처리군(treated)과 대조군(control) 값 두 세트를 각각 Ct-1, Ct-2 열에 입력합니다.
- 우선 하우스키핑 유전자(HKG) 섹션의 계산부터 완료합니다.
- 두 세트 값의 평균을 구하기 위해 AVERAGE 함수를 사용합니다.
- 셀 E6에 다음 수식을 입력합니다.
=AVERAGE(C6:D6)
- Enter 키를 누릅니다.
- 그다음 채우기 핸들을 더블클릭하여 수식을 셀 E11까지 복사합니다.
- 이제 3개의 대조군 값의 평균을 계산합니다.
- 병합된 셀 F6에 다음 수식을 입력합니다.
=AVERAGE(E9:E11)
- Enter 키를 누릅니다.
- 이제 셀 G6을 선택하고 ∆Ct 값을 구하는 다음 수식을 입력합니다. 이때 셀 F6은 반드시 절대 참조(Absolute Cell Reference)로 입력해야 합니다.
=E6-$F$6
- 다시 Enter 키를 누릅니다.
- 채우기 핸들을 더블클릭하여 수식을 셀 G11까지 복사합니다.
이것으로 하우스키핑 유전자(HKG) 섹션의 모든 계산이 완료되었습니다.
- 동일한 과정을 반복하여 관심 유전자(GOI) 섹션의 계산도 모두 완료합니다.
- 마지막으로 셀 O6에 다음 수식을 입력하여 발현 비율(expression ratio)을 구합니다. 셀 N6과 H6은 반드시 절대 참조로 입력하세요.
=($N$6^M6)/($H$6^G6)
- 마지막으로 Enter 키를 누릅니다.
- 채우기 핸들을 더블클릭하여 수식을 셀 O11까지 복사합니다.
모든 샘플의 발현 비율 값이 계산됩니다.
이렇게 Pfaffl 방법으로도 엑셀에서 qPCR 데이터를 성공적으로 분석할 수 있습니다.
결론
여기까지 엑셀에서 qPCR 데이터를 분석하는 두 가지 방법을 알아보았습니다. 이 글이 도움이 되었기를 바랍니다. 추가 질문이나 제안이 있다면 아래 댓글 섹션에서 자유롭게 의견을 남겨 주세요.
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